Mikroskop za desktop gigapiksele: 10 koraka (sa slikama)

2024 Autor: John Day | [email protected]. Zadnja izmjena: 2024-01-30 08:07

U optičkim mikroskopima postoji fundamentalni kompromis između vidnog polja i rezolucije: što su sitniji detalji, to je područje manje snimljeno mikroskopom. Jedan od načina za prevladavanje ovog ograničenja je prevođenje uzorka i snimanje slika u većem vidnom polju. Osnovna ideja je spojiti mnoge slike visoke rezolucije u veliku FOV. Na ovim slikama možete vidjeti i cijeli uzorak, kao i fine detalje u bilo kojem dijelu uzorka. Rezultat je slika koja se sastoji od oko milijardu piksela, mnogo veću u odnosu na slike snimljene dSLR -om ili pametnim telefonom, koji obično imaju oko 10 do 50 miliona piksela. Pogledajte ove pejzaže gigapiksela za impresivnu demonstraciju ogromne količine informacija na ovim slikama.

U ovom uputstvu ću razmotriti kako da napravim mikroskop sposoban da prikaže vidno polje 90 mm x 60 mm sa pikselima koji odgovaraju 2 μm na uzorku (mada, mislim da je rezolucija verovatno bliža 15 μm). Sistem koristi objektive fotoaparata, ali se isti koncept može primijeniti pomoću mikroskopskih objektiva kako bi se dobila još finija rezolucija.

Postavio sam slike gigapiksela koje sam dobio mikroskopom na EasyZoom:

Slika časopisa National Geographic iz 1970

Kukičani stolnjak koji je napravila moja žena

Razna elektronika

Ostali izvori:

Vodiči za optičku mikroskopiju:

Optička rezolucija:

Osim spajanja slika, nedavni napredak u računalnom snimanju omogućuje mikroskopiranje gigapiksela čak i bez pomicanja uzorka!

Korak 1: Lista zaliha

Materijali:

1. Nikon dSLR (koristio sam svoj Nikon D5000)

2. Objektiv žižne daljine 28 mm sa navojem od 52 mm

3. Objektiv žižne daljine 80 mm sa navojem od 58 mm

4. Obrnuta spojnica od 52 mm do 58 mm

5. Stativ

6. Sedam listova šperploče debljine 3 mm

7. Arduino Nano

8. Dva H-mosta L9110

9. Dva IC odašiljača

10. Dva IC prijemnika

11. Pritisnite dugme

12. Dva 2.2kOhm otpornika

13. Dva 150Ohm otpornika

14. Jedan otpornik od 1 kOhm

15. Daljinsko izdanje za Nikon fotoaparat

16. Crna poster ploča

17. Hardverski komplet:

18. Dva koračna motora (koristio sam Nema 17 Bipolarni koračni motor 3.5V 1A)

19. Dva vijka od 2 mm

20. Četiri jastuka

21. Dvije matice s navojem

22. Dvije klizne čahure ležaja i linearna vratila 200 mm:

23. Napajanje 5V:

24. Žičana žica

Alati:

1. Laserski rezač

2. 3D štampač

3. Ključevi imbus

4. Rezači žice

5. Alat za umotavanje žice

Korak 2: Pregled sistema

Za prevođenje uzorka, dva koračna motora poravnata u ortogonalnim smjerovima pomiču pozornicu u smjeru x i y. Motorima se upravlja pomoću dva H-mosta i Arduina. IR senzor postavljen na dnu koračnog motora koristi se za nuliranje stupnjeva tako da ne nailaze na oba kraja blokova. Digitalni mikroskop postavljen je iznad XY stupnja.

Kada se uzorak postavi i pozornica centrira, pritisnite dugme za početak prikupljanja. Motori pomiču pozornicu u donji lijevi kut i aktivira se kamera. Motori zatim prevode uzorak u malim koracima, jer kamera snima fotografiju u svakom položaju.

Nakon što su snimljene sve slike, slike se zatim spajaju i tvore sliku gigapiksela.

Korak 3: Sastavljanje mikroskopa

Napravio sam mikroskop sa malim uvećanjem sa dSLR-om (Nikon 5000), Nikon objektivom od 28 mm f/2.8 i Nikon objektivom sa zumom od 28-80 mm. Objektiv zuma je postavljen za žižnu daljinu jednaku 80 mm. Komplet dva sočiva djeluje poput objektiva cijevi mikroskopa i objektiva. Ukupno povećanje je omjer žižnih daljina, oko 3X. Ovi objektivi zaista nisu dizajnirani za ovu konfiguraciju, pa da bi se svjetlost širila poput mikroskopa, morate postaviti graničnik otvora između dva objektiva.

Prvo montirajte objektiv veće žižne daljine na kameru. Izrežite krug od crne poster ploče promjera otprilike veličine prednje površine objektiva. Zatim izrežite mali krug u sredini (odabrao sam promjer oko 3 mm). Veličina kruga će odrediti količinu svjetlosti koja ulazi u sistem, koja se naziva i numerički otvor (NA). NA određuje bočnu rezoluciju sistema za dobro dizajnirane mikroskope. Pa zašto ne biste koristili visoku NA za ovo postavljanje? Pa, postoje dva glavna razloga. Prvo, kako se NA povećava, optičke aberacije sistema postaju sve izraženije i ograničavaju rezoluciju sistema. U nekonvencionalnom postavljanju poput ovoga, to će vjerojatno biti slučaj, pa povećanje NA na kraju više neće pomoći poboljšanju rezolucije. Drugo, dubina polja takođe zavisi od NA. Što je NA NA, dubina polja je manja. Ovo otežava fokusiranje objekata koji nisu ravni. Ako NA postane previsoka, bit ćete ograničeni na dijapozitive mikroskopa koji imaju tanke uzorke.

Pozicioniranje graničnika otvora blende između dva objektiva čini sistem otprilike telecentričnim. To znači da je uvećanje sistema neovisno o udaljenosti objekta. Ovo postaje važno za spajanje slika zajedno. Ako objekt ima različitu dubinu, tada će pogled s dva različita položaja promijeniti perspektivu (poput ljudskog vida). Spajanje slika koje nisu iz sistema telecentričnog snimanja izazov je, posebno s tako velikim povećanjem.

Pomoću obrnute spojnice objektiva od 58 mm do 52 mm pričvrstite objektiv od 28 mm na objektiv od 80 mm sa otvorom blende postavljenim u sredini.

Korak 4: XY scenski dizajn

Dizajnirao sam scenu pomoću Fusion 360. Za svaki smjer skeniranja postoje četiri dijela koja je potrebno 3D ispisati: držač za montiranje, dva produžetka klizne jedinice i držač s olovnim vijkom. Baza i platforme XY pozornice laserski su izrezane od šperploče debljine 3 mm. Baza sadrži motor i klizače u smjeru X, X-platforma drži motor i klizače u smjeru Y, a Y-platforma drži uzorak. Baza se sastoji od 3 lista, a dvije platforme od 2 lista. Datoteke za lasersko rezanje i 3D ispis nalaze se u ovom koraku. Nakon rezanja i ispisa ovih dijelova spremni ste za sljedeće korake.

Korak 5: Sklop nosača motora

Pomoću alata za umotavanje žice omotajte žicu oko kabela dva IC odašiljača i dva IC prijemnika. Označite žice bojama kako biste znali koji je kraj. Zatim odrežite kabele s dioda, tako da od tada teku samo žice za umotavanje žice. Gurnite žice kroz vodilice u nosaču motora, a zatim gurnite diode na mjesto. Žice su usmjerene tako da nisu vidljive sve dok ne izađu sa stražnje strane jedinice. Ove žice se mogu spojiti sa žicama motora. Sada montirajte koračni motor pomoću četiri vijka M3. Ponovite ovaj korak za drugi motor.

Korak 6: Montaža pozornice

Zalijepite rezove baze 1 i baze 2, jedan od njih sa šesterokutnim otvorima za matice M3. Nakon što se ljepilo osuši, udarite matice M3 na mjesto. Matice se neće okretati kada se pritisnu u ploču, pa ćete kasnije moći uvrnuti vijke. Sada zalijepite treći osnovni list (baza 3) da pokrije matice.

Sada je vrijeme za sastavljanje nosača olovne matice. Uklonite svu dodatnu nit sa držača, a zatim gurnite četiri matice M3 u položaj. Čvrsto se uklapaju, pa malom odvijačem očistite prostor između vijaka i matica. Nakon što su matice poravnane, gurnite olovnu maticu u držač i pričvrstite je s 4 vijka M3.

Na postolje pričvrstite blokove jastuka, klizače i nosač motora za linearni prevoditelj u smjeru X. Stavite sklop vodeće matice na vodeći vijak, a zatim gurnite vodeći vijak na mjesto. Spojnicom spojite motor na glavni vijak. Postavite klizne jedinice u šipke, a zatim gurnite šipke u držače klizača. Na kraju, pričvrstite produžetke nosača klizača s vijcima M3.

Listovi šperploče X1 i X2 ljepljeni su na sličan način za podlogu. Isti postupak se ponavlja za linearni prevoditelj u Y-smjeru i fazu uzorka.

Korak 7: Elektronika skenera

Svaki koračni motor ima četiri kabela koji su spojeni na modul H-mosta. Četiri kabela iz IC odašiljača i prijemnika spojena su na otpornike prema gornjoj shemi. Izlazi prijemnika spojeni su na analogni ulaz A0 i A1. Dva modula H-mosta spojena su na pin 4-11 na Arduino Nano. Taster je spojen na pin 2 sa 1kOhm otpornikom za jednostavan unos korisnika.

Konačno, okidač za dSLR spojen je na daljinski zatvarač, kao što sam učinio za svoj CT skener (pogledajte korak 7). Odrežite kabel daljinskog zatvarača. Žice su označene na sljedeći način:

Žuta - fokus

Crvena - kapci

Bijelo - tlo

Da biste fokusirali snimak, žuta žica mora biti spojena na masu. Da biste snimili fotografiju, i žuta i crvena žica moraju biti spojene na masu. Spojio sam diodu i crveni kabel na pin 12, a zatim sam spojio drugu diodu i žuti kabel na pin 13. Postavljanje je kao što je opisano u uputama DIY Hacks and How-Tos.

Korak 8: Nabavite slike u gigapikselima

U prilogu je kôd za mikroskop gigapiksela. Koristio sam Stepper biblioteku za upravljanje motorima pomoću H-mosta. Na početku koda morate navesti vidno polje mikroskopa i broj slika koje želite dobiti u svakom smjeru.

Na primjer, mikroskop koji sam napravio imao je vidno polje od oko 8,2 mm x 5,5 mm. Stoga sam usmjerio motore da pomaknu 8 mm u smjeru x i 5 mm u smjeru y. Prikuplja se 11 slika u svakom smjeru, ukupno 121 slika za sliku punog gigapiksela (više detalja o ovome u koraku 11). Kod zatim izračunava broj koraka koje motori moraju napraviti da prevedu stupanj za ovu količinu.

Kako stupnjevi znaju gdje su u odnosu na motor? Kako se faze prevode bez pogađanja oba kraja? U kodu za postavljanje napisao sam funkciju koja pomiče pozornicu u svakom smjeru sve dok ne prekine putanju između IC odašiljača i IC prijemnika. Kada signal na IC prijemniku padne ispod nekog praga, motor se zaustavlja. Kôd zatim prati položaj pozornice u odnosu na ovu početnu poziciju. Kôd je napisan tako da motor ne prevodi previše što bi dovelo do toga da stupanj naleti na drugi kraj vodećeg vijka.

Kad se pozornica kalibrira u svakom smjeru, pozornica se prevodi u središte. Koristeći stativ, postavio sam svoj dSLR mikroskop preko pozornice. Važno je poravnati polje kamere s ukrštenim linijama na stupnju uzorka. Kada se pozornica poravna s kamerom, zalijepio sam scenu nekom slikarskom trakom, a zatim stavio uzorak na scenu. Izoštravanje je podešeno z-smjerom stativa. Korisnik tada pritisne dugme za početak akvizicije. Pozornica se prevodi u donji lijevi kut i aktivira se kamera. Pozornica skenira uzorak, dok kamera snima fotografiju na svakoj poziciji.

Priložen je i neki kôd za rješavanje problema motora i IC senzora.

Korak 9: Spajanje slika

Sa svim stečenim slikama sada ste suočeni s izazovom da ih sve spojite. Jedan od načina rukovanja spajanjem slika je ručno poravnavanje svih slika u grafičkom programu (koristio sam Autodesk's Graphic). Ovo će definitivno uspjeti, ali može biti bolan proces, a rubovi slika primjetni su na slikama u gigapikselima.

Druga mogućnost je korištenje tehnika obrade slika za automatsko povezivanje slika. Ideja je pronaći slične značajke u preklapajućem odjeljku susjednih slika, a zatim primijeniti translacijsku transformaciju na sliku tako da se slike poravnaju jedna s drugom. Konačno, rubovi se mogu spojiti zajedno množenjem preklapajućeg dijela s linearnim težinskim faktorom i zbrajanjem. Ovo može biti zastrašujući algoritam za pisanje ako ste tek počeli obrađivati slike. Neko sam vrijeme radio na problemu, ali nisam mogao dobiti potpuno pouzdan rezultat. Algoritam se najviše borio sa uzorcima koji su imali vrlo slične karakteristike, poput tačaka na slici časopisa. U prilogu je kôd koji sam napisao u Matlabu, ali treba malo poraditi.

Posljednja opcija je korištenje programa za spajanje fotografija od gigapiksela. Nemam šta predložiti, ali znam da su tu.

Korak 10: Performanse mikroskopa

U slučaju da ste propustili, evo rezultata: slika časopisa, stolnjak za kukičanje i razna elektronika.

Specifikacije sistema navedene su u gornjoj tabeli. Pokušao sam snimiti objektivima žižne daljine 28 mm i 50 mm. Procijenio sam najbolju moguću rezoluciju sistema na osnovu granice difrakcije (oko 6μm). Zapravo je teško ovo eksperimentalno testirati bez cilja visoke rezolucije. Pokušao sam odštampati vektorsku datoteku navedenu na ovom fotografskom forumu velikog formata, ali sam bio ograničen rezolucijom štampača. Najbolje što sam mogao otkriti ovim ispisom je da je sistem imao rezoluciju <40μm. Takođe sam tražio male, izolovane karakteristike na uzorcima. Najmanja karakteristika u štampi iz časopisa je mrlja tinte, za koju sam procijenio da je takođe oko 40 μm, pa je nisam mogao koristiti za bolju procjenu rezolucije. Bilo je malih zastoja u elektronici koji su bili prilično dobro izolirani. Budući da sam poznavao vidno polje, mogao sam izbrojati broj piksela koji zauzimaju mali zaokret kako bih dobio procjenu rezolucije, oko 10-15μm.

Sve u svemu, bio sam zadovoljan performansama sistema, ali imam nekoliko napomena u slučaju da želite isprobati ovaj projekat.

Stabilnost pozornice: Prvo nabavite visokokvalitetne linearne komponente pozornice. Komponente koje sam koristio igrale su mnogo više nego što sam mislio. Koristio sam samo jedan od klizača u kompletu za svaku šipku, pa se možda zato pozornica nije osjećala stabilnom. Pozornica mi je radila dovoljno dobro, ali to bi postalo veći problem za sisteme većeg uvećanja.

Optika za veću rezoluciju: Ista ideja može se koristiti za mikroskope većeg uvećanja. Međutim, bit će potrebni manji motori s finim korakom. Na primjer, uvećanje od 20X s ovim dSLR-om rezultiralo bi vidnim poljem od 1 mm (ako mikroskop može prikazati tako veliki sistem bez vinjetiranja). Elektropodatak je koristio koračne motore sa CD playera u lijepoj konstrukciji za mikroskop većeg povećanja. Drugi kompromis bit će plitka dubinska oštrina, što znači da će snimanje biti ograničeno na tanke uzorke i trebat će vam finiji mehanizam prevođenja u z-smjeru.

Stabilnost stativa: Ovaj sistem bi bolje funkcionirao sa stabilnijim postoljem za kameru. Sistem objektiva je težak i stativ je nagnut za 90 stepeni od položaja za koji je dizajniran. Morao sam zalijepiti nožice stativa kako bih pomogao u stabilnosti. Zatvarač bi takođe mogao potresti kameru dovoljno da zamuti slike.